ELISA檢測是一種廣泛應(yīng)用在測定液體樣本中的蛋白、抗體、或激素的免疫分析技術(shù)。酶聯(lián)免疫吸附試驗的標(biāo)準(zhǔn)程序,通常是把蛋白、抗體、或激素等(即抗原)直接或是以捕捉抗體(capture Ab)固定在固相載體上,再加入一級檢測抗體(primarydetection Ab),形成一個抗原抗體的復(fù)合物。如果該抗體已經(jīng)用酶(enzyme)標(biāo)記了,即可用來直接測定抗原的量,若無,則可利用另一個酶標(biāo)記的二級抗體來測定抗原的量。測定抗原量的方法是加入該酶的底質(zhì)(substrate),作用后產(chǎn)生出現(xiàn)的顏色深淺和樣本中的抗原量呈正比的關(guān)系,依此原理計算出樣本中的抗原總量或濃度。
組織樣本:肉、肝食品類切細,用絞肉機反復(fù)絞碎,混合均勻。水產(chǎn)樣本:去除樣品的非食用部分,食用部分切細,用均質(zhì)器均漿;原料表面較臟時,需適當(dāng)用蒸餾水清洗。蛋類:鮮蛋去殼,蛋黃和蛋白充分混勻。水果、蔬菜類:先用水洗去泥沙,然后除去表面的水分,取食用部分。
ELISA檢測詳細步驟如下:
1.標(biāo)本的采取和保存
可用作ELISA測定的標(biāo)本十分廣泛,體液(如血清)、分泌物(唾液)和排泄物(如尿液、糞便)等均可作標(biāo)本以測定其中某種抗體或抗原成份。有些標(biāo)本可直接進行測定(如血清、尿液),有些則需經(jīng)預(yù)處理(如糞便和某些分泌物)。
2.試劑的準(zhǔn)備
按試劑盒說明書的要求準(zhǔn)備實驗中需用的試劑。ELISA中用的蒸餾水或去離子水,包括用于洗滌的,應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的。
3.加樣
在ELISA中一般有3次加樣步聚,即加標(biāo)本,加酶結(jié)合物,加底物。加樣時應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可濺出,不可產(chǎn)生氣泡。
4.保溫
在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應(yīng),即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后。抗原抗體反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時間,這一保溫過程稱為溫育(incubation),有人稱之為孵育,在ELISA中似不恰當(dāng)。
5.洗滌
洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應(yīng)步驟,但卻也決定著實驗的成敗。ELSIA就是靠洗滌來達到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì),以及在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。